lb培养基的配方详解，高效感受态细胞制作？

实验·原理
通过电击法或CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂处理，使细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。RbCl法制备的感受态细胞转化效率较高。
实验试剂· 器材
试剂
器材

文章插图
操作方法
一、LB培养基配制（固体培养基加2%琼脂粉）
酵母粉YeastExtract5g蛋白胨Peptone/g10gNaCl10g水1000ml二、TFBI溶液配制
RbCl(氯化铷)5g1M KAc(醋酸钾)12.3ml1M CaCl2(氯化钙)4.1ml1M MnCl2(氯化锰，粉色)20.5mlglycerol(甘油)61.5g0.1M HAc(醋酸)8ml 调节pH至5.8超纯水补足至410ml配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌三、TFBII溶液配制
1M MOPS（pH6.5，溶液为黄色)1.5ml1M CaCl2(氯化钙)11.25ml1M RbCl1.5mlglycerol(甘油)22.5g1M KOH(氢氧化钾)调节pH至6.5超纯水补足至150ml配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌四、高效感受态细胞制备
1. 取实验室-80℃保存的DH5α菌种在无抗性的LB平板上划线，37℃培养过夜，进行活化；
2. 从LB平板上挑取单菌落，尽量选择菌落较饱满，边缘平滑，个头较大、长势较好的菌落；
3. 挑选上述单菌落接种于装有10ml无抗性LB液体培养基的25ml锥形瓶中；
4. 37℃下振荡培养过夜（摇床转速 200rpm，12h左右），进行充分活化；
5. 将上述菌液以1:100的比例接种到大的锥形瓶中，37℃振荡培养2～2.5h（尽量不要超时），至OD590达0.4~0.6；
6. 将培养好的菌液转入洁净无菌的50ml离心管中，冰上放置10min（此时，可以将配置好的TBFI溶液冰浴预冷，离心机预冷至4℃，如果离心机降温较慢，最好再提前一点）；
7. 在4℃下，4000rpm离心10min，弃去上清；
8. 加入初始细菌培养基1/2.5的冰上预冷的TBFI溶液（如果前面使用的是60ml，这里则为60/2.5=24ml），轻轻悬浮细胞，冰上放置10min；
9. 4℃，4000rpm离心10min，弃去上清；
10. 加入初始细菌培养基1/25体积的预冷TBFII（如果前面使用的是60ml，这里则为60/25=2.4ml，也即为TBFI的1/10，当然具体体积也可以根据个人经验上下变动），轻轻悬浮菌沉；
11. 分装至EP管中，每管分装100μl（EP管最好预冷，分装过程要求在冰上进行）。
12. -80℃冰箱长期保存，定期活化，有利于长期保存。（保存中不要断电，否则细胞可能失活）。
[ 特别提示 ]
-80℃冰箱储存的感受态细胞在6-8周后，转化率很快降低，可用已知标准及浓度的闭环质粒鉴定感受态细胞的转化能力。
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